《微生物的實驗室培養》教案分析

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《微生物的實驗室培養》教案分析

　　培養基：人們按照微生物對營養物質的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養基質，是進行微生物培養的物質基礎。

《微生物的實驗室培養》教案分析

　　培養基按照物理性質可分為液體培養基半固體培養基和固體培養基。在液體培養基中加入凝固劑瓊脂（是從紅藻中提取的一種多糖，在配制培養基中用作凝固劑）后，制成瓊脂固體培養基。微生物在固體培養基表面生長，可以形成肉眼可見的菌落。根據菌落的特征可以判斷是哪一種菌。液體培養基應用于工業或生活生產，固體培養基應用于微生物的分離和鑒定，半固體培養基則常用于觀察微生物的運動及菌種保藏等。

　　按照成分培養基可分為人工合成培養基和天然培養基。合成培養基是用成分已知的化學物質配制而成，其中成分的種類比例明確，常用于微生物的分離鑒定。天然培養基是用化學成分不明的天然物質配制而成，常用于實際工業生產。

　　按照培養基的用途，可將培養基分為選擇培養基和鑒定培養基。選擇培養基是指在培養基中加入某種化學物質，以抑制不需要的微生物生長，促進所需要的微生物的生長。鑒別培養基是根據微生物的特點，在培養基中加入某種指示劑或化學藥品配制而成的，用以鑒別不同類別的微生物。

　　培養基的化學成分包括水、無機鹽、碳源、氮源（生長因子）等。

　　碳源：能為微生物的代謝提供碳元素的物質。如CO2、NaHCO3等無機碳源；糖類、石油、花生粉餅等有機碳源。異養微生物只能利用有機碳源。單質碳不能作為碳源。

　　氮源：能為微生物的代謝提供氮元素的物質。如N2、NH3、NO3-、NH4+（無機氮源）蛋白質、氨基酸、尿素、牛肉膏、蛋白胨（有機氮源）等。只有固氮微生物才能利用N2。

　　培養基還要滿足微生物生長對PH、特殊營養物質以及氧氣的要求。例如，培養乳酸桿菌時需要在培養基中添加維生素，培養霉菌時須將培養基的pH調至酸性，培養細菌是需要將pH調至中性或微堿性，培養厭氧型微生物是則需要提供無氧的條件

　　無菌技術獲得純凈培養物的關鍵是防止外來雜菌的入侵，要注意以下幾個方面：

　　①對實驗操作的空間、操作者的衣著和手，進行清潔和消毒。

　　②將用于微生物培養的器皿、接種用具和培養基等器具進行滅菌。

　　③為避免周圍環境中微生物的污染，實驗操作應在酒精燈火焰附近進行。

　　④實驗操作時應避免已經滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸。

　　無菌技術除了用來防止實驗室的培養物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？

　　答：無菌技術還能有效避免操作者自身被微生物感染。

　　消毒與滅菌的區別

　　消毒指使用較為溫和的物理或化學方法僅殺死物體表面或內部一部分對人體有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。消毒方法常用煮沸消毒法，巴氏消毒法（對于一些不耐高溫的液體）還有化學藥劑（如酒精、氯氣、石炭酸等）消毒、紫外線消毒。

　　滅菌則是指使用強烈的理化因素殺死物體內外所有的微生物，包括芽孢和孢子。滅菌方法有灼燒滅菌、干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌。

　　滅菌方法：

　　①接種環、接種針、試管口等使用灼燒滅菌法；

　　②玻璃器皿、金屬用具等使用干熱滅菌法，所用器械是干熱滅菌箱；

　　③培養基、無菌水等使用高壓蒸汽滅菌法，所用器械是高壓蒸汽滅菌鍋。

　　④表面滅菌和空氣滅菌等使用紫外線滅菌法，所用器械是紫外燈。

　　倒平板操作的討論

　　1.培養基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養基的溫度？

　　提示：可以用手觸摸盛有培養基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進行倒平板了。

　　2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？

　　答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養基。

　　3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？

　　答：平板冷凝后，皿蓋上會凝結水珠，將平板倒置，既可以防止培養基表面的水分過度地揮發，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養基，造成污染。

　　4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養微生物嗎？為什么？

　　答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養基上滋生，因此最好不要用這個平板培養微生物。

　　純化大腸桿菌

　　（1）微生物接種的方法最常用的是平板劃線法和稀釋涂布平板法。

　　（2）平板劃線法是通過接種環在瓊脂固體培養基表面連續劃線的操作。將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養基的表面。在數次劃線后培養，可以分離到由一個細胞繁殖而來的肉眼可見的子細胞群體，這就是菌落。

　　（3）稀釋涂布平板法是將菌液進行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養基的表面，進行培養。分為系列稀釋操作和涂布平板操作兩步。

　　（4）用平板劃線法和稀釋涂布平板法接種的目的是：使聚集在一起的微生物分散成單個細胞，從而能在培養基表面形成單個的菌落，以便于純化菌種。

　　（5）平板劃線法操作步驟：

　　①將接種環放在火焰上灼燒，直到接種環燒紅。②在火焰旁冷卻接種環，并打開棉塞。

　　③將試管口通過火焰。④將已冷卻的接種環伸入菌液中蘸取一環菌液。

　　⑤將試管通過火焰，并塞上棉塞。⑥左手將皿蓋打開一條縫隙，右手將沾有菌種的接種環迅速伸入平板內，劃三至五條平行線，蓋上皿蓋。注意不要劃破培養皿。⑦灼燒接種環，待其冷卻后，從第一區域劃線的末端開始往第二區域內劃線。重復以上操作，在三、四、五區域內劃線。注意不要將最后一區的劃線與第一區相連。⑧將平板倒置放入培養箱中培養。

　　平板劃線操作的討論

　　1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環？在劃線操作結束時，仍然需要灼燒接種環嗎？為什么？

　　答：操作的第一步灼燒接種環是為了避免接種環上可能存在的微生物污染培養物；每次劃線前灼燒接種環是為了殺死上次劃線結束后，接種環上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環上的菌種直接于上次劃線的末端，從而通過劃線次數的增加，使每次劃線時菌種的數目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結束后灼燒接種環，能及時殺死接種環上殘留的菌種，避免細菌污染環境和感染操作者。

　　2.在灼燒接種環之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線？

　　答：以免接種環溫度太高，殺死菌種。

　　3.在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？

　　答：劃線后，線條末端細菌的數目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數目隨著劃線次數的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。

　　（6）涂布平板操作的步驟：

　　①將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中。②取少量菌液，滴加到培養基表面。

　　③將沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃盡后，冷卻8～10s。

　　④用涂布器將菌液均勻地涂布在培養基表面。

　　涂布平板操作的討論

　　涂布平板的所有操作都應在火焰附近進行。結合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第2步應如何進行無菌操作？

　　提示：應從操作的各個細節保證“無菌”。例如，酒精燈與培養皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍；等等。

　　菌種的保存