環肽藥物合成方法的簡要

環肽藥物合成方法的簡要

　　環肽藥物合成方法的簡要

　　摘要：多肽合成藥物在治療上的重要性，越來越引起廣大藥學工作者的重視。

　　根據肽鏈的構成可將多肽分為同聚肽(Homomeric)和雜聚肽(Heteromeric)兩大類，前者完全由氨基酸組成，后者是由氨基酸部分和非氨基酸部分組成的，如糖肽。

　　根據肽鍵的結構又分為直鏈肽和環肽。

　　其中直鏈肽的研究最為廣泛和深入，尤其在直鏈肽的合成技術方面無論是液相法還是固相法都已成熟。

　　環肽藥物合成的方法還存在一些問題，下面就對這些方法進行研究和探討。

　　關鍵詞：環肽 合成 方法

　　根據環肽的環合方式又分為首尾相連環肽、側鏈和側鏈相連環肽、側鏈和端基相連環肽、含二硫橋的環肽、以及含有其他橋連結構的環肽。

　　從合成方法上講，首尾相連的環肽的合成難度最大。

　　因為環肽的前體-直鏈肽的肽鍵具有很強的p鍵特征，分子更偏愛形成反式構象，呈舒展狀態，造成屬于反應中心的端基的羧基和氨基在空間上距離較遠，不利于發生分子內縮合反應，有利于分子間縮合。

　　一、活潑酯法

　　活潑酯法中活化羧基和環合反應是分兩步進行的。

　　活潑酯相對很穩定，一般不需要純化可直接用于環合反應。

　　幾乎所有可用于偶聯反應的活潑酯都可用于合成環肽，主要有對硝基酚酯、N-羥基琥珀酰亞胺酯、五氟苯酯和2,4,5-三氯苯酚酯。

　　線性多肽的C端羧基與對硝基酚、N-羥基琥珀酰亞胺、五氟苯酚或2,4,5-三氯苯酚，在DCC或其他縮合劑存在下，于低溫反應，很容易得到相應的活潑酯。

　　這種N端通常帶有BOC或Z保護的活潑酯在酸性條件下脫去保護基，形成活潑酯的氫鹵酸鹽，在弱堿性稀溶液中，如在吡啶，DMF或二氧六環一類介電常數較大的溶劑中，保持pH8~9，加熱(60~100°C)或室溫攪拌數小時至數日，最終可得到環肽。

　　二、迭氮法

　　在多肽合成中迭氮法是另一種比較經典的方法，這種方法的優點在于很少引起消旋反應，最早用于直鏈肽的合成，現在常常被用于環肽的合成。

　　具體方法是，把直鏈肽的甲酯，乙酯，芐酯，取代芐酯或其它更活潑的酯通過肼解的方式生成酰肼，溶于醋酸或鹽酸-醋酸混合溶液，在-5°C左右的溫度下加入1M的亞硝酸鈉溶液，產生的亞硝酸則與酰肼反應生成迭氮物。

　　N端游離的直鏈肽迭氮物于4°C攪拌一天再升溫至室溫，可得環肽。

　　Bodansky最早應用迭氮法合成了cyclo(D-Ala-D-Ala-Val-D-Leu-Ile)，雖然上述環肽不具有其母體化合物malformin的生物活性，但合成它為應用迭氮法合成環肽開辟了前景。

　　應用迭氮法合成環肽的另一個成功的例子是內皮素拮抗劑的合成。

　　Endothelin(ET)是一種高效的血管收縮劑，由21個氨基酸殘基組成，其受體拮抗劑之一cyclo(D-Trp-D-Asp(OtBu)Fmoc-Ser-D-Val-Leu)的合成過程如下：

　　DPPA系二苯基磷酰基迭氮化物，是一種穩定的液體，沸點157°C，用二苯基磷酰氯和NaN3在丙酮中室溫反應很方便地得到，可以直接用作多肽偶聯的縮合劑，近年來多用于環肽的合成。

　　Arg-Gly-Asp(RGD)是多種細胞外蛋白與整合素相互作用時被整合素識別的關鍵序列，對含有該序列環肽的合成報道很多。

　　Kessler等用固相合成儀SP650合成了13個含RGD序列的線性六肽和七個含RGD序列的線性五肽，N端和C端均游離的直鏈肽在稀溶液中以DPPA為縮合劑，保持pH8.5~9，反應4天，得到相應的環六肽和環五肽，收率在15%~50%之間。

　　生物活性實驗表明所有的環六肽對細胞粘附的抑制作用均明顯低于線性肽GRGDS。

　　三、固相法合成環肽

　　固相法能夠有效地避免環合過程中二聚、多聚等副反應的發生。

　　早在60年代，Fridkin等就應用高分子載體來合成環肽。

　　線性多肽的C端羧基與樹脂形成酯鍵而將線性肽掛在樹脂上，脫去N端保護基后，以三乙胺中和，室溫12小時后得到60%~80%收率的環肽，具體過程如下：

　　近年來發展起來的通過氨基酸側鏈與樹脂連接合成環肽的策略在環肽合成中應用廣泛。

　　對具有天冬氨酸或谷氨酸殘基的線性多肽，可選擇這兩個酸性氨基酸殘基的側鏈羧基為C端，與PAC(烷氧基芐醇)或PAL(烷氧基芐胺)或其他類型樹脂縮合，將線性多肽掛在樹脂上。

　　主鏈羧基用烯丙基保護。

　　逐步接肽完成之后脫去N端和C端保護基，加入縮合劑得到連在樹脂上的環合產物。

　　最后用三氟醋酸：茴香硫醚：b-巰基乙醇：苯甲醚混合試劑從樹脂上切下環肽，同時脫去其它側鏈保護基。

　　采用這種策略完成了Cyclo(Ala-Ala-Arg-D-Phe-Pro-Glu-asp-Asn-Tyr-glu)的合成，收率為71%。

　　這種方法的局限性在于線性多肽前體中必需包含天冬氨酸或天冬酰氨，谷氨酸或谷氨酰胺。

　　四、酶法合成環肽：

　　在緩沖液中利用蛋白酶合成環肽也是正在發展的方法之一。

　　Jackson等報道了以線性多肽酯的衍生物為底物，通過酶催化成環的方法合成了幾個包含12~25個氨基酸殘基頭尾相接的環肽，環化用的酶Subtiligase是枯草桿菌蛋白酶突變的產物，催化反應體系為pH=8的緩沖溶液。

　　用HPLC檢測，收率在30%~80%之間。

　　環化效率與肽的序列和長度有關。

　　利用Subtiligase合成環肽所需的線性肽的最小長度是12個氨基酸殘基，低于此數將得到水解產物或線性肽二聚產物。

　　可能是因為低于12個殘基的肽底物形成的頭尾相接的空間構象不能與酶的活性中心匹配。

　　五、合成環肽的其它方法

　　下面介紹幾種比較特殊的環肽合成方法：

　　Meuterman等人巧妙地將光敏感輔助劑融合在環肽合成過程中，這種與常規合成方法不同的策略，不僅豐富了環肽合成方法學的內容，也為其他合成工作者提供了想象空間。

　　直鏈五肽H-Ala-Phe-Leu-Pro-Ala-OHH-Ala-Phe-Leu-Pro-D-Ala-OH和H-Phe-Leu-Pro-Ala-Ala-OH在常規條件下，溶于DMF，使成為10-3~10-4M溶液，加入3倍量Bop為縮合劑，5倍量DIEA作為堿和催化劑，未得到單體環合化合物，只得到了環二聚體和環三聚體。

　　采用光敏輔助劑的方法，將5-硝基-2-羥基芐基和6-硝基-2-羥基芐基以及巰基乙基等光敏結構引入線性肽N端，這些結構中的羥基或巰基與C端羧基成酯后，使得N端與C端在空間位置上更為接近，經酰基轉移使環縮小而得到N端連有光敏輔助劑的環肽，最后經光解反應脫去光敏輔助劑，得到首尾相連的環五肽，收率為20%，以Cyclo(Ala-Phe-Leu-Pro-Ala)的合成為例，具體過程如下：

　　在傳統的環肽合成方法中，不僅線性肽前體的氨基酸側鏈一般都需要保護，而且要求反應物在溶液中呈高度稀釋狀態，非保護的氨基酸的環合無論是在概念上還是在機理上都不同于傳統環合方法，主要特征是(1)酰胺鍵在沒有活化劑存在下，通過分子內酰基轉移而形成;(2)兩個反應端基在緩沖液中的可逆反應造成環-鏈的結構互變，調節和控制環的形成。

　　這種非保護環肽的合成方法避免了煩瑣的保護和脫保護步驟以及反應液高度稀釋的要求，終產物可直接用于生物活性實驗。

　　JameP.Tam等建立了分子內轉移硫內酯化和Ag+離子輔助環合來制備非保護環肽的方法。

　　對于N端為半胱氨酸，C端為硫酯的線性多肽，在pH=7的磷酸緩沖液中，巰基與硫酯基生成共價的硫內酯，這種硫內酯自發地經過S原子到N原子酰基遷移而形成環肽，對于不含半胱氨酸的線性多肽的環合，采用親硫的Ag+離子輔助配位柔性的線性多肽的N端氨基與C端硫酯形成一個環狀的中間體，通過熵活化促進分子內環合。

　　與硫內酯環合方法原理相似，Ag+離子通過一種非經典環-鏈結構互變而促使分子內環合的發生。

　　由于環肽的前體-直鏈肽所包含的氨基酸的數目和種類的千差萬別，造成了環肽合成方法的多樣化。

　　對某種直鏈肽表現出高效，快速縮合作用的試劑和方法對另外一種肽鏈就可能變得低效或無效。

　　因此，根據目標環肽的序列尋找對應的環肽合成方法必須通過認真的探索和艱辛的努力。

　　參考文獻：

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