氧環境影響關節軟骨細胞表型的相關研究分析

氧環境影響關節軟骨細胞表型的相關研究分析

　　由于軟骨自身修復能力差，一旦損傷即產生永久性病變。那么，氧環境影響關節軟骨細胞表型的相關研究是?

　　【摘要】 [目的]觀察檢測低氧和常氧條件下原代和傳代后軟骨細胞各特異性基因及蛋白表達的改變。[方法]采用3～5日齡c57bl/6小鼠，取四肢關節軟骨，經機械分離和酶消化法獲得關節軟骨細胞，將原代細胞p0和傳代后細胞p1、p2分別在普通和低氧培養箱中培養2 d，用rt-pcr檢測ii型膠原、可聚蛋白聚糖和sox9特異性基因及ihh、pthrp、bmp4、wnt5a分化相關基因的表達差異，原代軟骨細胞用免疫組化和阿利新藍染色檢測ii型膠原、可聚蛋白聚糖的蛋白表達。[結果]低氧條件下，免疫組化顯示ii型膠原和可聚蛋白聚糖的表達較普通培養增強，ii型膠原、wnt5a的基因表達增強，ihh的表達降低;傳代后軟骨細胞的蛋白、特異性基因和分化相關基因表達未見明顯差異。[結論]低氧條件下，原代軟骨細胞的ii型膠原表達增強，且可能主要是受ihh、wnt5a等分化相關基因的調控。短期單層培養方式不能明顯改善、 恢復特異性基因表達降低的傳代后軟骨細胞表型。

　　【關鍵詞】 軟骨細胞　低氧　ⅱ型膠原　蛋白聚糖

　　effect of oxygen tension on chondrocytic phenotype in vitro

　　liang jing, deng lian-fu, zhu ya-ping，et al.

　　shanghai institute of traumatology and orthopaedics, orthopaedic department of ruijin hospital, shanghai 200025, china

　　abstract: [objective]to examine the specific gene and protein expression of primary and passaged chondrocytes in normal oxygen tension and hypoxia. [methods]articular chondrocytes were isolated from limb joint cartilage of c57bl/6 mice (3～5 days). primary chondrocytes (p0) and passaled chondrocytes (p1, p2) were cultured in normal oxygen tension and hypoxia respectively for two days.the mrna levels of collagen ii, aggrecan, sox9, indian hedgehog (ihh), parathyroid hormone-related protein (pthrp), bone morphogenetic protein (bmp)-4 and wnt5a were examined with rt-pcr, and protein levels of collagen ii,aggrecan were examined with immunohistochemistry and toluidine blue staining.[results]during the culture of primary chondrocyte, the expression of collagen ii and aggrecan increased under hypoxia, mrna levels of collagen ii, wnt5a increased and ihh decreased at the same time.the mrna levels of special genes and differentiation related genes of passaged chondrocytes were not altered under hypoxia.[conclusion]protein and mrna level of collagen ii of primary chondrocyte under hypoxia increased. it may be regulated by chondrocyte differentiation gene ihh,and wnt5a. the chondrocyte phenotype could not be resumed under hypoxia through short-term monolayer culture in vitro.

　　key words：chondrocyte; hypoxia; collagen type ii; aggrecan

　　正常生理情況下，關節軟骨無直接的血液供應，主要通過關節滑液和軟骨下骨組織來間接提供，與其它由動脈血供應的組織相比，關節滑液的氧分壓僅約7%，關節軟骨表層的氧分壓為7%，深層則低于1%，故體內軟骨細胞是始終處于低氧環境中的。wWW.133229.COm關節損傷、退變等病理情況時，損傷、炎癥等引起關節滑液中氧分壓明顯降低，導致軟骨內氧分壓相應下降，影響細胞外基質新陳代謝，將會直接或間接影響關節軟骨細胞的正常代謝和功能發揮[1]。軟骨細胞在體外單層培養時隨傳代次數增多細胞易發生去分化，細胞呈成纖維細胞樣變，ii型膠原及可聚蛋白聚糖表達減少，i型膠原表達增加[2]。為進一步了解低氧對體外培養的軟骨細胞表型變化的影響，本實驗擬觀測低氧與常氧條件下原代和傳代后軟骨細胞各特異性基因、分化相關基因及蛋白量的改變。

　　1 材料和方法

　　1.1 關節軟骨細胞的分離和培養

　　3～5 d齡c57bl/6小鼠20只，斷頸法處死，75%酒精浸泡3 min。在超凈臺上用眼科剪離斷四肢，解剖顯微鏡下清理髖、膝、肩、肘關節周圍皮膚、肌肉和軟組織，分離出軟骨塊，放入盛有dmem(gibco，usa)培養基的培養皿中。d-hanks液沖洗2次，將軟骨塊剪碎，置入錐形瓶中用5倍體積的0.25%胰蛋白酶(sigma)，37℃預消化半小時，過濾后將軟骨塊重新置入錐形瓶用0.2%的膠原酶(sigma)繼續消化，待大部分軟骨塊消失，終止消化。過濾獲得細胞懸液，1 200 r/min離心8 min，去上清，無血清培養基洗滌2次，所得細胞沉淀重懸于含10%胎牛血清(jrh，usa)的dmem中，按2.5×105/ml接種于25 cm2培養瓶中，以8×105/ml接種于預置有蓋玻片的24孔板中，設3個復孔，置于37℃、5%co2飽和濕度的培養箱中培養，即p0，每2 d換1次液。

　　1.2 rt-pcr檢測軟骨細胞特異基因和分化相關基因的表達

　　1.2.1 細胞標本收集

　　待5 d細胞長滿后以相同密度接種傳代即p1、p2，并分別將70%～80%融合的p0、p1、p2置于普通培養箱和2%o2(n2平衡)培養箱(model 3110，thermo)中培養2 d。用trizol裂解沉淀細胞后，抽提rna。

　　1.2.2 rt-pcr反應

　　取rna 2 μg，隨機引物1μl， 加水至12 μl ，70℃5 min置于冰上;5×反應緩沖液4 μl，10 mmdntp 2 μl，rnase抑制劑0.5 μl，加水至19 μl ，25℃ 5 min;逆轉錄酶(m-mlv)1 μl，42℃ 1 h，70℃10 min，置于冰上終止反應。按照94℃5 min～-94℃30秒，以各基因退火溫度30秒，72℃20秒～-72℃ 7 min進行pcr反應，各基因引物見表1。取10 μl pcr反應產物行瓊脂糖凝膠電泳。用天能凝膠圖像處理儀紫外燈下觀察并拍照。

　　1.3 軟骨細胞表型鑒定

　　將不同氧環境下24孔板中的玻片取出，進行ii型膠原和蛋白聚糖(aggrecan)的免疫組化染色及阿利新藍染色。

　　1.3.1 ii型膠原和aggrecan的免疫化學染色

　　培養細胞依次執行下列步驟：吸去培養液，pbs洗2次，10 min/次;4%多聚甲醛室溫固定15 min;3%h2o2離子水孵育10 min，消除內源性過氧化酶活性;牛血清白蛋白封閉20 min;一抗ii型膠原(1∶100)、aggrecan(1∶50)孵育過夜;二抗37℃孵育1 h;加abc30～60 min;滴加dab液，鏡下觀察顯色;pbs緩沖液沖洗，脫水，透明，封片。

　　1.3.2 阿利新藍染色

　　吸去培養液，pbs洗2次，10 min/次;4%多聚甲醛室溫固定15 min;pbs洗3次，3 min/次;1%阿利新藍染色30 min;蒸餾水沖洗;脫水，透明，封片。

　　2 結果

　　2.1 軟骨細胞形態學觀察

　　接種后24 h，倒置顯微鏡下觀察，大部分小圓形細胞已經貼壁。繼續培養，典型的軟骨細胞為上皮樣細胞，外形為多邊形或圓形，胞漿豐富，胞核圓形，居中。鏡下細胞有立體感。5 d左右細胞融合，呈明顯的鋪路石樣外觀。傳代后，細胞由圓形、多邊形變成長梭形，并有大量的突起出現。

　　2.2 軟骨細胞標志性基因和分化相關基因表達(圖1、表2)

　　rt-pcr半定量結果：各樣本基因表達量=各樣本目的基因凈光密度/各樣本β-actin凈光密度(x-±s，n=3)。經機械分離和酶消化方法獲得的細胞表達ii型膠原、sox9和aggrecan，并且低氧培養時標志性基因的表達高于普通培養。傳代后，特異性基因的表達量降低，低氧培養和普通培養未見有明顯差異。ihh的表達：原代軟骨細胞及傳代后p1低氧培養時低于普通培養，傳代后p2兩種條件下均無ihh的表達。pthrp的表達：原代和傳代后軟骨細胞低氧培養時pthrp的表達均低于普通培養，且傳代對pthrp的表達沒有什么影響。bmp4的表達：低氧條件下，隨著傳代，軟骨細胞bmp4的表達逐漸降低，普通培養時bmp4的表達基本一致，且原代細胞低氧時bmp4表達高于常氧，傳代后p2低于常氧。bmp7的表達：原代細胞兩種條件下bmp7的表達沒有明顯差異，傳代后p2低氧培養時bmp7表達明顯高于普通培養。wnt5a的表達：傳代后，wnt5a的表達降低，且兩種條件下沒有明顯差異。原代軟骨細胞低氧培養時wnt5a的表達高于普通培養。表1 rt-pcr反應各基因引物序列及反應條件目的基因引物序列產物大小

　　(略)

　　2.3 細胞免疫化學染色和阿利新藍染色(圖2)

　　低氧和普通培養時原代軟骨細胞均有大量免疫化學染色陽性的棕褐色細胞和阿利新藍染色陽性細胞，低氧時軟骨細胞著色多深于普通培養。傳代后，細胞形態由圓形、多邊形變為長梭形，且胞體變大，突起增多，ii型膠原和aggrecan染色著色變淡，兩種條件培養沒有明顯差異。

　　2.4 統計分析

　　rt-pcr半定量結果用均數±標準差(x-±s)表示，采用spss 11.5軟件進行分析，用非配對t檢驗，p<0.05有統計學意義。

　　3 討論

　　關節軟骨急性損傷、慢性勞損及年齡增長引起的退變等病理情況下，由于軟骨自身修復能力差，一旦損傷即產生永久性病變。隨著組織工程學的發展，關節軟骨損傷的修復技術也取得了長足進展。種子細胞-軟骨細胞的來源及體外的擴增培養是組織工程學修復軟骨的重要環節。軟骨組織較之其他血供豐富的組織器官，其組織內氧分壓更低。在關節軟骨組織不同區帶，氧分壓存在著差異，介于1%～7%之間。軟骨細胞處于低氧環境，通過糖酵解獲取能量。低氧是軟骨細胞生長和存活的一個關鍵因素。低氧可促進軟骨細胞分化和軟骨基質合成，但抑制軟骨細胞的最終分化，并且低氧能明顯促進間充質細胞向軟骨細胞方向分化，促進軟骨基質合成，在細胞培養和器官培養中均抑制最終分化[3]。所以適宜的氧環境也是體外軟骨細胞生存的重要條件。表2 常氧和低氧條件下關節軟骨細胞p0、 p1、p2各基因mrna表達的rt-pcr半定量結果(略)

　　軟骨細胞為維持軟骨的特性會分泌特異的蛋白。ii型膠原是關節軟骨內表達最多的膠原蛋白，它與其他膠原相互交織形成纖維網，使軟骨組織具有張力和剪力特性，并固定基質中的蛋白多糖。可聚蛋白聚糖是軟骨基質內另一個重要組成部分，它由一個核心蛋白與糖胺聚糖以共價結合。sox9是調控間充質細胞向軟骨方向分化的必要因子，sox9表達后，進一步誘導下游相關基因ii型膠原等的表達。

　　murphyl等[4]用藻酸鈣包被去分化的軟骨細胞，4周后發現低氧條件下(5%)培養的軟骨細胞的特異性基因ii型膠原表達與原代完全相同，可聚糖胺多糖及sox9的表達甚至高于原代細胞。本實驗中，原代軟骨細胞經低氧干預后，ii型膠原的基因表達明顯高于普通培養，免疫組化染色和阿利新藍染色也證實ii型膠原和蛋白聚糖的表達增高。傳代后，軟骨細胞的標志性基因表達降低，發生去分化，低氧干預和普通培養條件下沒有明顯差異。在軟骨內骨形成過程中，ihh/pthrp和bmps家族參與了對軟骨細胞分化的調控。ihh/pthrp形成負反饋環來調控軟骨細胞向肥大軟骨細胞分化的啟動，而bmps家族也和這一負反饋環相互作用，參與調控。ihh可以促進軟骨細胞增殖，并促使軟骨細胞由增殖期向肥大期轉化，分泌x型膠原。ihh信號活化后，可以上調pthrp的表達，pthrp可以使軟骨細胞維持在增殖狀態，抑制增殖性軟骨細胞的肥大化分化，并下調ihh的表達。另外，ihh也可以不依賴于pthrp直接調控軟骨細胞增殖[5]。有實驗證實，外源性bmp4能以劑量依賴方式促進軟骨生長、基質沉積和軟骨細胞增殖，較大劑量能夠誘導異位肥大軟骨細胞的生成[6]。wnt5a在增殖型軟骨細胞和前肥大軟骨細胞表達，可以促進軟骨細胞增殖，維持軟骨細胞變為關節/靜息軟骨細胞的狀態，抑制其分化[7]。普通培養條件下，軟骨細胞傳代后各分化相關基因表達基本不變;低氧培養時，ihh的表達較常氧降低，wnt5a的表達較常氧升高，說明低氧條件更利于軟骨細胞保持增殖狀態，傳代后，ihh、 bmp4的表達較常氧均下降，wnt5a與常氧相似，則可能ihh和bmp4參與了低氧條件下傳代后軟骨細胞表型的調控。低氧條件下原代及傳代后軟骨細胞pthrp表達低于常氧培養，可能是由于ihh表達量較低不足以啟動ihh/pthrp負反饋環。本實驗證實越接近于體內環境更容易保持軟骨細胞的生物學特性，但是傳代后軟骨細胞經低氧單層短期培養，并未見明顯的軟骨細胞特異的表型基因表達的增高，所以單純的氧環境改變并不能恢復軟骨細胞的表型。

　　組織工程修復關節是治療關節損傷、退變的重要手段，而維持體外軟骨細胞表型是需要解決的關鍵技術。低氧環境接近于體內的生理環境，本實驗中低氧條件下原代軟骨細胞的表型基因表達較常氧增高，促進軟骨細胞分化的基因ihh表達降低，抑制軟骨細胞分化的基因wnt5a表達增高。由此，低氧環境也許是組織工程中軟骨細胞準備的必要條件，更易于發揮修復材料的治療作用。

　　低氧是體內軟骨細胞的生存環境，體外培養也觀察到軟骨細胞較之常氧培養時表型特異性基因的表達增強，但是低氧條件下引起軟骨細胞特性改變的使動因素、相關基因和病理條件下(骨關節炎等)、年齡增大引起的關節軟骨內氧濃度降低沒能逆轉軟骨細胞的變性，其原因還不是很清楚，這有待于進一步研究。

　　【參考文獻】

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　　[3]hirao m, tamai n, tsumaki n,et al.oxygen tension regulates chondrocyte differentiation and function during endochondral ossification[j].j biol chem，2006，41:31079-31092.

　　[4]murphyl cl, polak jm. control of human articular chondrocyte differentiation by reduced oxygen tention[j].j cell physiol，2004,3:451-459.

　　[5]mackie ej,ahmed ya,tatarczuch l,et al.endochondral ossification:how cartilage is converted into bone in the developing skeleton[j].int j biochem cell biol，2008，1:46-62.

　　[6]shum l, wang x, kane aa,et al.bmp4 promotes chondrocyte proliferation and hypertrophy in the endochondral cranial base[j]. int j dev biol，2003，6:423-431.

　　[7]yingzi y, lilia t, heuijung l,et al.wnt5a and wnt5b exhibit distinct activities in coordinating chondrocyte proliferation and differentiation[j]. development，2003，5:1003-1015.

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