益氣活血方藥對老年大鼠肝臟衰老相關基因表達的影響

【關鍵詞】 肝細胞

［摘要］目的：觀察益氣、活血方藥對老年大鼠肝臟衰老相關基因表達的影響。方法：以自然衰老大鼠為衰老模型，采用RTPCR、Western blotting法研究益氣、活血方藥對老年大鼠肝臟p16、p21、增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen, PCNA）、cyclin D1和cyclin E mRNA轉錄和蛋白表達的影響。結果：老年大鼠肝臟p16、p21、cyclin D1 mRNA轉錄和蛋白的表達增加；PCNA、cyclin E mRNA轉錄和蛋白的表達降低。與老年大鼠比較，益氣、活血方藥可下調老年大鼠肝臟cyclin D1 mRNA轉錄和蛋白表達，上調促進增殖基因cyclin E mRNA轉錄和蛋白表達，但對p16、p21和PCNA的調節作用不明顯。結論：益氣、活血方藥主要通過調控cyclin D1和cyclin E mRNA轉錄和蛋白表達而促進細胞增殖。

　　［關鍵詞］衰老大鼠; 肝細胞; p16; p21; 增殖細胞核抗原; cyclin D1; cyclin E; 益氣方; 活血方

　　Effects of recipes for replenishing qi and activating blood on senescence related gene expressions in the liver of aging rats

　　ABSTRACT Objective: To observe the effects of recipes for replenishing qi and activating blood on p16, p21, proliferating cell nuclear antigen (PCNA), cyclin D1 and cyclin E gene expressions in the liver of aging rats. Methods: A recipe for replenishing qi and a recipe for activating blood were administered to aging rats respectively, and the effects of the above recipes on the expressions of senescence related genes (p16, p21, PCNA, cyclin D1 and cyclin E) were examined by RTPCR and Western blotting methods. Results: The expressions of p16, p21 and cyclin D1 mRNAs and proteins in the liver of the untreated aging rats were upregulated, while the expressions of PCNA and cyclin E mRNAs and proteins decreased. As compared with the untreated aging rats, both recipes could downregulate the expressions of cyclin D1 mRNA and protein and upregulate the expressions of cyclin E mRNA and protein, but had no obvious effects on the expressions of mRNAs and proteins of p16, p21 and PCNA. Conclusion: Recipes for replenishing qi and activating blood can improve the liver cell proliferation of aging rats via downregulating the expressions of cyclin D1 mRNA and protein and upregulating the expressions of cyclin E mRNA and protein.

　　KEY WORDS aging rats; hepatocytes; p16; p21; proliferating cell nuclear antigen; cyclin D1; cyclin E; qibenefiting recipe; bloodactivating recipe

　　隨著細胞及分子生物學的發展，已經發現一些與細胞衰老密切相關的基因及轉錄因子（反式作用因子）［1～3］。縱觀歷代中醫文獻，延緩衰老的方藥基本屬于補腎、健脾、益氣和活血范疇。近代研究顯示：上述四類方藥均有不同程度抗自由基、調節免疫功能、提高肝臟蛋白質含量、改善肝臟超微結構等延緩衰老的作用［4］。實驗研究還表明：補腎方藥能促進老年大鼠肝臟cHras、cmyc、cfos、cjun mRNA的表達，下調p53 mRNA的表達［5］。本實驗從細胞增殖調控角度，根據中醫理論，從益氣活血的抗衰經典方中分別選擇幾味有代表性的中藥組成小復方，以自然衰老大鼠為衰老模型，應用RTPCR和Western blotting法研究益氣、活血方藥對老年大鼠肝臟衰老相關基因p16、p21、cyclin D1、增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)和cyclin E表達的影響。

　　1材料與方法

　　1.1實驗中藥 益氣方選用黨參、黃芪、炙甘草（取自《時氏醫道》保元湯），活血方選用川芎、當歸、赤芍（取自經方四物湯）。中藥制劑采用水提醇沉法制備后，分裝于消毒好的塑料瓶中，于－20 ℃保存。

　　1.2實驗動物 SD雄性大鼠（上海中醫藥大學實驗動物中心提供）24只，分成青年對照組（5月齡）、老年對照組（22月齡）、老年益氣組（22月齡）和老年活血組（22月齡）。老年益氣組和活血組的用藥劑量為臨床成人劑量的20倍（按每千克體質量的用藥量進行換算），采用飲料方式給藥，每周服藥5 d，停藥2 d，自18～22月齡連續給藥4個月。

　　1.3RTPCR 肝組織細胞總的RNA按Trizol一步法提取，具體步驟按試劑說明書操作。βactin PCR引物［6］：5’CCAGCCATGTACGTTGCTATCCAG 3’，5’GGAACCGCTCATTGCCAATGGTGA 3’，擴增片段為378 bp；p16 PCR引物：5’ATGGAGTCCTCTGCAGATAG 3’，5’TTAG CGCTGCTTTGGGGGTT 3’，擴增片段為480 bp；p21PCR引物：5’ATGTCCGATCCTGGTGATGT3’，5’GGGCTTTCTCTTGCAGAAGA 3’，擴增片段為495 bp；cyclin D1 PCR引物：5’ATGGAACACCAGCTCCTGTG 3’，5’TGGTGTTCCATGTCGGTGG 3’，擴增片段為888 bp；PCNA PCR引物：5’ATGTTTGAGGCACGCCTGAT3’，5’AGATCCTTCTTCATCTTCGA 3’，擴增片段為786 bp；cyclin E PCR引物：5’AAAGAAGAAGGTGGTTCCGA 3’，5’TCATTCTGTCTCCT GCTCAC 3’，擴增片段為1 191 bp。PCR擴增反應總體積為50 μl。擴增程序為：95 ℃（30 s）→ ［變性94 ℃（30 s）→退火55 ℃(30 s)→延伸72 ℃ (30 s)］×30個循環→72 ℃ （7 min）→4 ℃貯存。根據目的片段的長短及引物的Tm值設置退火溫度及延伸時間。PCR產物鑒定電泳，紫外燈下觀察，圖像分析系統掃描。

　　1.4Western Blotting 采用放射免疫沉淀測定法(radioimmunoprecipitation assay, RIPA)［7］。取肝臟組織100 mg加入單去污細胞裂解液900 μl，冰浴中勻漿。勻漿后立即加入100 μl蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟液(phenylmethylsulphonyl fluoride, PMSF)和40 μl混合蛋白酶抑制complete液(complete EDTAfree protease inhibitor cocktail tablet, 1片加1 ml水），4 ℃ 10 000 r/min離心10 min，取上清液于－70 ℃冷凍保存。24 h后10 000 r/min離心10 min，取上清液分裝，－70 ℃冷凍保存。Lowry (FolinCiocalteau)法［8］測定蛋白含量。各組蛋白各取30 μg，采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecylsulfatepolyacrylamide gel electrophoresis, SDSPAGE)和免疫印跡反應，用Supersignal ECL發光劑熒光顯色X光膠片曝光，觀察蛋白條帶。

　　1.5圖像處理及統計分析 RTPCR、Westernblotting實驗結果分別采用Leica Q500IW和上海復日Smartview 2001生物電泳圖像分析系統進行圖像分析。所有實驗數據均采用SPSS 9.0統計軟件進行統計處理，統計學方法采用方差分析及q檢驗。

　　2結果

　　2.1益氣、活血方藥對大鼠肝臟衰老相關基因mRNA表達的影響與青年組比較，老年大鼠肝臟p16、p21、cyclin D1基因mRNA的表達明顯上調（P

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